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查理五世取得的巨大成功使教皇也感到害怕了，两次反法同盟的盟友教皇克力门七世也起来反对他了。教皇组织了科涅克同盟，在法国领导下反对查理五世。查理派遣了一支军队在波旁公爵的率领下进攻罗马。波旁公爵在罗马城下战死，于是他率领的约两万德意志和西班牙雇佣军便失去了控制。1527年5月，他们冲进罗马城烧杀抢掠，把圣体盒拿去当夜壶，把十字架当靶子，把修道院改成妓院，教皇也被捉了。此事被认为是文艺复兴终结的标志。两年后，查理在博罗尼亚会见了教皇，这是天主教皇帝与教皇的第一次会面，他双膝跪下，为罗马事件表示歉意，教皇原谅了他。三个月后，查理接受了神圣罗马帝国的金皇冠后，坚持为教皇执镫，表示他精神上服从教皇。
此时的法国选择了和土耳其联合。在海上； 法国、土耳其和热那亚的舰队于1528 年对西班牙舰队及那不勒斯和西西里采取了联合行动； 迫使查理五世不得不全力关注地中海。 1536年，法土条约签订后，法国和土耳其海军常常一起行动，法国的马赛港就停泊着土耳其军舰。1538 年法土舰队进攻威尼斯；同年的普雷维沙海战后； 奥斯曼帝国开始享有地中海的海上优势； 查理五世受到遏制。1542 年； 法土两国又一次采取海上联合行动； 进攻那不勒斯、西西里和尼斯。在行动过程中； 土耳其舰队停靠土伦港； 并设立了海军前线指挥所； 以至当时该港被称为“君士坦丁堡第二”。亨利二世继承王位后； 继续执行其父佛朗西斯一世的政策； 仍保持与土耳其的同盟关系； 同时在欧洲大陆和地中海打击哈布斯堡王朝。因此； 法土同盟的重要意义在于： 法国把奥斯曼帝国的力量引入到欧洲国际关系； 将整个欧洲大陆的敌人引入欧洲大陆的权力政治之中； 迫使哈布斯堡王朝陷于两线作战的窘境；从而最终在欧洲恢复并维持了一种均势，维护了法国和其他正在兴起的、反抗查理五世霸权企图的国家的独立和自由。
1544年，查理五世攻入法国，法国求和。３年后，佛朗西斯死后，他的儿子亨利二世又恢复了战争。查理五世在1556年退位后，战争在亨利二世和菲利浦二世之间进行，1557年和1558年法军连遭失败后，两国于1559年签订了《卡托…康布雷西和约》，实现了和平，法国的安全也得到了保障。《卡托…康布雷西和约》也标志着查理五世欧洲霸权图谋的失败和以均势为基础的欧洲体系的初步形成。
反对宗教改革
除意大利战争外，查理五世还有一件烦心事，那就是在德意志发生的宗教改革。查理计划的首要目标是统一德意志，以壮大帝国的力量。因此，自诩为天主教正统的查理不会容忍反对罗马天主教廷的宗教改革。然而不可遏止的洪流还是把他的计划冲得七零八落。
从15世纪下半叶开始，欧洲的资本主义经济开始发展，这需要有一个统一的国内市场和强大的政府作为自己发展经济的后盾，但德意志境内分布的大大小小各行其是的独立力量严重阻碍了经济的发展。当时的教会也日益腐化，当欧洲各国纷纷建立中央集权政府抵制腐化的教会时，教会仍利用德意志的分裂进行掠夺。据统计，在16世纪初，每年从德意志流入教会的财富为30万金币，而当时的德意志税收只有1？4万金币，德意志成了“教皇的奶牛”，这招致了广泛的反对。当时全德意志约有1/3的土地属于教会财产，这是各路诸侯不能容忍的。
1517年，教会大力推行赎罪券，宣称只要买赎罪券的钱币落入钱箱时叮当一响，其已死亲属的灵魂马上就从炼狱飞升天堂。这种说法与维腾堡大学神学教授马丁？路德从《圣经》中所得出的理论完全相反。1517年11月1日晨，马丁？路德将著名的《九十五条论纲》贴在了维腾堡教堂的大门上。由于印刷术的帮助，《九十五条论纲》迅速传播，被译成多种文字，一个月之中就传遍了整个欧洲。形势的发展使原本对《九十五条论纲》不屑一顾的教皇利奥十世不得不重视起来。1519年3月，经过谈判，马丁？路德写信向教皇请罪，并呼吁德意志各阶层忠于罗马教会。尽管路德作了让步，但教会中的强硬派不肯罢休，他们派出了著名神学家约翰？艾克与路德辩论，结果路德输了。1520年，教皇驻德使节宣布将路德开除教籍；当众焚毁其著作。教皇于6月15日勒令马丁？ 路德放弃自己的观点，于是路德被迫与教会决裂。
面对宗教改革，此时的德意志政治舞台上出现了三派势力：一是反对宗教改革的保守派；一是主张建立摆脱罗马教会控制的国家教会的温和改革派；一是主张变革整个社会制度的激进改革派。查理五世出于正统的天主教观念，支持保守派。但由于意大利战争的拖累以及不愿意得罪温和派势力，所以他采取了一种比较温和的方式对待马丁？路德。1521年４月18日，在沃尔姆斯帝国会议上威吓马丁？路德失败后的第二天，虽然查理五世发表声明说“朕决心用朕之王国和领土； 朕之朋友； 朕之身躯；朕之鲜血； 朕之生命及朕之心灵来捍卫它（天主教信仰）” ，表明了自己坚定的保守派思想。但他其实是在马丁？路德离开沃尔姆斯后才下逮捕令的，后来马丁？路德被支持宗教改革的选侯菲特烈派人以绑架的形式保护下来。5月6日，帝国会议发布了《沃尔姆斯敕令》，宣布马丁？路德为异端，并在帝国境内逮捕马丁？路德及其支持者。这只不过是一纸空文罢了。
1531年，新教徒们组织了一个斯玛卡德同盟，来反对查理五世和天主教诸侯，天主教诸侯则针锋相对地组织了一个纽伦堡同盟。1535年，为了镇压农民起义，力量不足的旧教徒旧教徒指支持罗马教会的诸侯，后文中的新教徒指支持路德派的诸侯。不得不寻求新教徒的帮助，新教徒趁机扩大势力。1536年，纽伦堡联盟瓦解，一些旧教诸侯也倒向新教徒。与此同时，英国和北欧诸国纷纷建立国家教会，脱离罗马教廷。原本信奉旧教的法国国王佛朗西斯一世为了对抗查理五世也转而支持新教徒。1540年，为了扭转局势，查理五世提出新旧教诸侯进行谈判，探讨建立德国教会的可能性。在谈判破裂后，1546年，查理五世决定动用武力来打败新教徒。在作战中，不顾自己痛风的毛病，他骑在一匹大黑马上达21个小时，而且始终冲在前面。1550年，他颁布《血腥诏令》，宣布镇压新教，恢复旧教的统治。这个明显抬高世俗皇权的诏令引起了教皇和所有诸侯的不安，他们结成同盟共同反对查理五世。1552年查理五世被打败。1555年，双方缔结《奥格斯堡和约》，承认路德派的合法地位，并确立了“教随国定”的原则，承认各诸侯拥有决定其臣民宗教信仰的权利。德国的宗教改革在其他国家引起了连锁反应，欧洲各国相继爆发了反对罗马教廷的宗教改革运动，派生出许多脱离罗马教廷的新教派，如路德宗、加尔文宗、安立甘宗等。宗教改革取得了成功，这其实是以宗教改革的形式揭开了资产阶级革命的序幕。查理梦寐以求的帝国境内的宗教统一变成了泡影，德意志不仅没有统一反而更分裂了。1556 年查理五世退位； 皇位传给他的弟弟斐迪南；统治着德意志帝国； 包括奥地利及其领地捷克和部分匈牙利；他的儿子菲利浦则统治西班牙、尼德兰和海外领地。查理帝国分解； 形成哈布斯堡王室的两个统治支系。
打击穆斯林
当查理在为帝国奔忙的时候，基督教的“老朋友”伊斯兰教又在欧洲东部方向威胁着欧洲诸国。神圣罗马帝国皇帝是基督教反对伊斯兰教的天然保护人，查理的先辈伊莎贝拉女王光复整个西班牙的辉煌也促使他具有这种使命感。然而这时的奥斯曼土耳其在其历史上最伟大的苏丹苏莱曼的统治下国力强盛，横跨亚、非、欧，是当时世界上最强大的国家之一。他们的行政管理是当时世界上最好的行政管理之一，他们还拥有让欧洲许多国家羡慕的财政平衡。他们的军队训练有素，装备精良。这样的一个强国，欧洲各大国都在避其锋芒。只有查理五世怀有击败异端的宗教热情，想要打败苏莱曼。轻率的企图产生了荒谬的行动。1526年，土耳其军队在莫哈奇大败查理五世的军队。1529年，维也纳受到围攻。
查理五世也不是没有胜利过。1534年，突尼斯哈夫斯王朝发生内乱，苏丹穆莱？哈桑被著名的“红胡子”巴巴洛萨就是红�