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牛顿仍对奇妙的视觉现象迷惑不解，就小心翼翼地将一个薄薄的小刀片插入自己的眼角。“我将小刀片插入我的眼睛和骨头之间，尽量往眼球后面延伸：用刀片的末端压迫我的眼睛（为的是使眼球弯曲），结果出现了好几个白色、黑色和其它色彩的圆圈。” 在另一项实验中，他透过一支羽毛观看落日（和詹姆斯·格雷果里做的实验一样），发现了“光辉灿烂的色彩。”
在1664年8月斯陶尔布里奇的集市上，牛顿买了一个玻璃棱镜。毫无疑问，他得到了笛卡尔将太阳光分成光谱色彩实验的灵感。大约在这个时候，牛顿也开始了彻夜观测天空。12月10日，他看到了一颗彗星。一周之后，另一颗彗星在凌晨4：30出现。他连续每天夜里都进行观测，从圣诞节到他的22岁生日，一直到一个月之后这颗彗星完全消失为止。牛顿急需一架望远镜，但是因为他买不起，就决定自己制作一架。他随即开始自己研磨透镜。他对模糊的镜片和周围令他困惑的光环很不满意。为了避免球面像差，他试图研磨非球面透镜（即笛卡尔所建议的双曲面或者椭圆面透镜），但是他却计算不出如何来做。
为了转换一下思维，牛顿摆弄起棱镜来。他将屋子捂得严严实实，漆黑一片，只在窗户上开个小孔，让一束光进入到黑暗中。他将棱镜放在光的入口处，发现在远端墙上“看到所产生的生动鲜艳的色彩很是一件令人愉悦的事情。” 但是这时他也注意到了某种奇怪的东西。“看到它们是长椭圆形令我很吃惊，因为根据折射的原理，我原来想它们应该是圆形的。”圆球状的白光被抻长了，成为了五彩缤纷的彩虹，竟比他料想的长了四倍。
牛顿将一个凸透镜放在棱镜所产生的彩虹光束里。当凸透镜重新将光束聚集时，光束在聚焦处再次变成白色，然后才带有各种色彩地向外延伸。这是否表明太阳光其实就是各种色彩光线的聚合，而每一束色彩光线又是以不同的角度折射过来的呢？牛顿又买了一个棱镜。他将这个棱镜以180度的角度与第一个棱镜相对，这时，长椭圆形的彩虹再次汇聚到一起，成了一个圆形的白色光束。
牛顿后来回忆道，“我开始怀疑，光线在通过棱镜之后是否是以曲线运行的。” 他毫无疑问受到了笛卡尔网球比喻的影响。他回忆说，“我经常看到网球是被一种斜拍子击打的，这可以描述这种曲线。” 但事实并不这样。很简单，把一些粉笔灰撒在空中，就可以看到光是以直线运行的。
接着，牛顿开始做他称之为的最关键的实验。他在第一个棱镜的外边放了一块中间钻有孔眼的板子。在12英尺外的地方，他又放了一块板子，上面也钻有一个孔眼。最后，他将第二个棱镜放在第二块板子的外面，其位置正好能将光束的一种颜色截住，并将其投放到墙上。牛顿慢慢转动在太阳光束中的第一个棱镜的轴，先是将一种颜色，然后是另一种颜色穿过第二块板上的圆孔。当一条单一色彩的光束通过第二个棱镜折射时，光束并没有变长，却在墙上形成了一个大概圆形的色彩光束。但事情并不这么简单。当他从红色继续到桔红色、黄色、绿色、蓝色、靛蓝和紫色时，小球状的光束逐渐爬到墙上，这样，这些色彩光束在一起时就会形成他最初看到的长椭圆形的彩虹。
牛顿从这些试验中得出结论，“光是由不同的可折射的光线组成的。不管它们的射入角（它们射入棱镜的角度）有什么不同，根据它们的可折射度，它们都会传射到墙壁上的各个部分。牛顿终于领悟了这个令他惊讶的现象，就不再研磨非球面体的透镜了。“当我明白这个道理时，我就放下了研磨玻璃的工作；因为我看到，所谓完美的望远镜都是有限度的，这并不是因为缺少完美的玻璃器件，而是因为光本身就是不同的可折射光线的混杂组合。” 这一现象解释了色差的问题。牛顿发现色差的效果远远超过了球面像差的效果。“不仅这样，我在想，发现了不同的可折射性真令我欣慰。望远镜应该达到光束可折射性的完美度。”
牛顿放弃了对折射望远镜的改进工作，开始重新考虑詹姆斯·格雷果里关于反射望远镜的计划。他曾经读过格雷果里1663年出版的《光学的进展》中关于反射望远镜的理论。与透镜不同的是，镜子不能将不同颜色的光束分离开。所有的光束都同时跳跃。他得出结论，通过反射望远镜，“光学仪器可以达到任何想象得到的完美度，条件是要能找到一个能反射的物质。这种物质能研磨得象玻璃一样平滑，能反射的光要象玻璃能传送的一样多，而且还要取得向其传递一个抛物面图形的艺术。从理论上讲，牛顿是对的，但是他意识到他面临着“非常大的困难，” 因为“反射表面的每一个不规则点都使光线比在折射表面上的不规则点远离轨道5倍或者6倍远。”换句话说，镜子的精确度要求要比透镜高得多。
牛顿回忆说，“尽管有这么多想法，我却被大瘟疫逼得离开了剑桥。” （注释2）由于腺鼠疫突发，剑桥大学于1665年7月被关闭。
（注释2）牛顿光学试验的先后顺序有些混乱。牛顿在别的场合曾写道，他在1666年初的时候开始研磨非球面透镜并且买了一个棱镜。但是在这里他却说，大瘟疫中断了他的工作，而大瘟疫是在1665年中期发生的。很显然，牛顿前后差了一年。他后来告诉某人，他的第一个棱镜是在1665年的斯陶尔布里奇集市上买的，而那只能是1664年，因为那个集市由于大瘟疫于1665年和1666年两年均被取消了。因此说，牛顿的关键性试验很有可能是在1665年初进行的， 而不是在1666年。
牛顿回到乌尔索普他母亲家后，开始对高等数学发生了兴趣。他也对神秘的万有引力进行了许多思考。据称，他受到一个苹果落地的启示，开始了认真地思考，终于在20年之后，发表了巨著《数学原理》。老年时他满怀激情地回忆道，“我当时正值发明的风华正茂年龄，比以往任何时候都更关心数学和哲学。”
直到1667年当他回到剑桥大学时，他才开始实施制作反射望远镜的计划。他自己铸造了合金铁（铜和锡的比例为三比一，还有一点儿砷）。因为“想到了要细细抛光，要适合这种金属，”他就用凸形的铜具细细研磨，然后用松脂抛光。这样，他做成了一面直径为一又三分之一英寸的凹透镜。为了把球面形改成抛物面形，他“用力地研磨镜面中间部分好长时间，” 但是镜面基本上还是球面形的，边沿向下。牛顿将镜片放在一支六英寸管的末端，在管子中间以45度角再放置一个小的附属平面镜（他避免了格雷果里的解决方法即在主镜上钻一个孔然后再做一个很难做的椭圆球面的附属镜片），这样，就将光束反射到旁边的一个目镜上。（见插图）
在牛顿的晚年，当人们问他他是在哪里制作的望远镜时，他回答是他自己做的。工具是从哪儿弄来的？牛顿放声大笑（在他郁闷的的一生中这是很少见的），说工具也是他自己做的。“如果我等着别人给我做工具什么的，我就什么也做不成了。” 牛顿用他1668年做成的新的望远镜看到了木星的四个卫星和金星的“带角的”的位相。1671年秋天，他又将望远镜做了改进。
这时，牛顿已被任命为第二任数学教授。他的前任艾萨克·巴罗主动让贤，向人们解释说，牛顿是个“非凡的天才、水平极高。”除了巴罗之外，没有几个人知道牛顿的工作和天才。牛顿既不善于交际又性格十分内向，内向得甚至达到了偏执狂的程度。牛顿的作品都没有用他自己的名字发表，只是勉强同意匿名发表了一篇数学论文。他写道，“我认为受公众瞩目没什么可取之处。那样也许会让很多人认识我，而那正是我不愿意做的。”
牛顿通过做讲座课并在大学图书馆里将其归档履行了教授的职责。1670年1月，他用拉丁语声调低沉地讲了他的第一堂课，主要是讲他的实验和反射望远镜。为数不多的学生都哈气连天。他的第二堂课每人再来听。他的助手回忆说，“没有几个人去听他讲课，理解他的人就更少了，因